23/12/15 |   Biotechnology and biosafety  Genetically modified organisms

Um sistema e um feijão transgênico para enfrentar o mosaico-dourado

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As plantas de feijão ficam anãs, amareladas, como que anêmicas; as folhas, encarquilhadas. As vagens e os grãos ficam deformados. Muitas flores são abortadas. O agricultor vê o problema no campo e sabe o futuro: se tiver sorte, irá lidar com perdas em torno de 40% da lavoura, mas corre o risco de perder tudo. O consumidor não toma conhecimento do problema, mas provavelmente pagará mais caro pelo feijão de qualidade que não foi afetado e chegará ao mercado.

A doença ocorre após o ataque da mosca-branca, que carrega o vírus do mosaico-dourado (chamado pelos cientistas de BGMV, nomenclatura técnica oficial do inglês Bean golden mosaic virus). A mosca é vetora do geminivírus, um grupo de vírus cujo genoma é composto por DNA e que é capaz de infectar várias espécies de plantas. O nome "mosaico-dourado" tem relação com o amarelecimento intenso, delimitado pela coloração verde, formando um mosaico verde-amarelo.

A Embrapa Arroz e Feijão estima que as perdas de feijão decorrentes de ataques seriam entre 90 e 300 mil toneladas, dependendo do ano, suficiente para alimentar algo entre seis milhões e 15 milhões de pessoas. A mosca-branca prefere períodos quentes e secos. Por isso, seu impacto maior ocorre em épocas específicas. A possibilidade de ocorrência do mosaico-dourado praticamente impede a produção de feijão em cerca de 200 mil hectares no período mais seco nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e parte da região Sul. Apenas o Rio Grande do Sul é menos suscetível à praga, pelas baixas temperaturas do inverno.

Renato Caetano é presidente da Associação dos Engenheiros-Agrônomos de Cristalina (GO) e consultor de vários agricultores na região do Brasil Central. Ele conhece muitos casos de perda total de lavouras nessa região. A disseminação da mosca trouxe limitação da época de plantio. A segunda das três épocas de plantio do feijão nas principais regiões produtoras do Brasil, conhecida como "safrinha" ou safra da "seca", com semeadura de janeiro a março, por exemplo, tornou-se impraticável na maior parte do País, obrigando o agricultor a buscar outras opções de cultivo. A área de produção no Município de Cristalina, que era de 40 mil hectares há oito anos, hoje é de 25 mil hectares.

A solução mais recente, recomendada pela Embrapa, é o vazio sanitário, ou seja, um período de ausência total de plantas vivas de feijão e de plantas espontâneas que sejam hospedeiras da mosca-branca na área de plantio. Todas as plantas devem ser eliminadas por meio de controle químico ou mecânico. A ausência das plantas hospedeiras em certo período reduz a transmissão de vírus de um cultivo para outro. "Está dando resultado. Reduz a capacidade de transmissão da virose",  explica Renato.

Mesmo adulta, a mosca que dá todo esse prejuízo tem o tamanho da cabeça de um alfinete, mas ataca em grupos, que podem chegar a 300 insetos por planta, segundo contagem de técnicos do Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Cali, Colômbia). Do ovo, depositado na parte inferior das folhas, à vida adulta, são apenas 19 dias, e durante este período já danifica e infecta a lavoura. As ninfas, recém-saídas dos ovos, circulam sobre as folhas para encontrar um lugar para si e começam a sucção da seiva e a injetar toxinas por meio de um mecanismo similar a um estilete.

Ou seja, a mosca suga uma planta, adquire o vírus pela primeira vez e vai passar o resto da vida transmitindo-o para todas as plantas em que se alimentar posteriormente. Quando voa, contamina outras lavouras e inviabiliza novos plantios, como explica Renato Caetano. E gosta de soja, algodão, uva, melancia, abobrinha, tomate, entre centenas de espécies de plantas. No feijoeiro, por causa do mosaico-dourado, o impacto é grande demais, principalmente antes do florescimento. 

Evolução rápida e desafiadora

O mosaico-dourado foi identificado pela primeira vez no Brasil, em 1961, na região de Campinas (SP). Era pouco importante, mas em alguns anos disseminou-se. Desde então, é desafio para os pesquisadores e tormento para quem planta feijão. Muitos pesquisadores de diferentes instituições fizeram esforços para identificar fontes de resistência e desenvolver cultivares resistentes. Em muitos casos, como o de outra virose também prejudicial à cultura do feijão, o mosaico-comum, o controle de doenças é feito de forma eficiente por meio do uso de cultivares resistentes, ou seja, pela resistência natural das plantas. Assim, foram testados vários materiais genéticos (germoplasma, base ou patrimônio genético da espécie usado como fonte de genes de interesse pelos programas de melhoramento) promissores e de diversas origens, inclusive em outros países, sempre com resultados insatisfatórios no que se refere à identificação de resistência efetiva ao mosaico-dourado. 
 
Após mais de duas décadas de tentativas, não foi possível desenvolver cultivares adaptadas às condições brasileiras com alta resistência à doença. O máximo que se alcançou foram fontes de tolerância, ou resistência intermediária, quantitativa, ainda que tenham sido testados milhares de acessos dos bancos de germoplasma de várias partes das Américas.
 
Ou seja, não foram identificadas até o momento fontes com resistência efetiva ao mosaico-dourado no Brasil. Para controlar a doença, o mais comum é a aplicação de inseticida, muito inseticida. Não é difícil encontrar relatos de 25 aplicações, o que, a longo prazo, causa a perda da eficiência num país que chega a plantar três safras anuais de feijão. E sabe-se que nenhuma estratégia de controle pode ser usada isoladamente. O ideal é a combinação do controle químico com medidas preconizadas pelo manejo integrado de pragas, inclusive o vazio sanitário, nem sempre suficientes. 
 
O pesquisador Thiago Souza, da Embrapa Arroz e Feijão, explica que "existe variabilidade genética dentro e entre as várias populações de mosca-branca no Brasil, e que o excesso de químicos acaba por selecionar os genótipos do inseto resistentes aos inseticidas". Na prática, o elevado uso de inseticidas intensifica a seleção e a consequente disseminação de novas gerações da mosca que são capazes de sobreviver às aplicações. "Por isso a recomendação histórica da pesquisa é adotar o modelo de manejo integrado de pragas. O uso de químicos é uma ferramenta importante para o manejo da mosca-branca, mas, quando adotado isoladamente e de forma indiscriminada, embora pareça uma solução conveniente e fácil, não é sustentável". 
 

Avanço com os fracassos

O investimento da Embrapa na busca de soluções para o vírus do mosaico-dourado se inicia no anos 1990, quando o pesquisador Josias Faria (foto), da Embrapa Arroz e Feijão, sequencia o vírus durante seu pós-doutorado. Na época, Francisco Aragão, outro personagem dessa história, tentava, na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, expressar no feijão um gene da castanha-do-pará, chamado 2S, para aumentar o teor de metionina. Conseguiu-se feijão geneticamente modificado (GM) naquela tentativa, mas os testes mostraram que a proteína 2S tinha potencial alergênico e o projeto foi encerrado. O conhecimento adquirido, entretanto, seria útil mais adiante. Josias queria resolver o problema do mosaico-dourado. Após a caracterização completa do vírus por sequenciamento, investiu em obter plantas que expressassem sequências virais (plantas GM).

O feijão não possui a capacidade de regeneração a partir de células individuais da planta. Não é como a soja, o tomate, a alface ou o fumo. Muito trabalho foi necessário para aprender a inserir genes no genoma do feijão e assim obter plantas GM. Distintas estratégias para a obtenção de plantas resistentes ao mosaico-dourado foram testadas, algumas não funcionaram e outras funcionaram apenas parcialmente. Por exemplo, Josias e Francisco usaram a estratégia de RNA antisense, que gerou apenas plantas com sintomas atrasados e mais brandos. Mas as plantas ainda eram suscetíveis à virose.

A segunda tentativa foi uma estratégia chamada de transdominância letal, que consistia em expressar na planta uma proteína modificada do vírus. Os novos testes de campo também não deram muito certo. Ataques em pequena escala tinham menos impacto, mas os maiores afetavam a produção e isto não bastaria para ajudar o agricultor.

O recomeço com o RNA interferente
Nos primeiros anos do século XXI, as pesquisas quase pararam. Exigiam-se até sete licenças para um único experimento de campo com plantas GM. Em 2004, chegou a haver comemoração formal na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia por receber uma licença para realizar os experimentos. Em 2005, com a readequação da legislação, diminuiu o esforço burocrático e aumentou o científico. E a pesquisa se concentrou em uma estratégia chamada de RNA interferente (RNAi), um mecanismo de silenciamento de genes inspirado em um processo biológico já presente na natureza, mas até então incompreendido pelos cientistas e, portanto, de difícil aplicação.

A solução veio com os trabalhos de cientistas que acabariam ganhando o Prêmio Nobel de Medicina em 2006. O biólogo e matemático Andrew Zachary Fire e o bioquímico Craig Mello desvendaram o mecanismo do RNAi. Trata-se do silenciamento gênico, a capacidade de reconhecer uma sequência-alvo específica de RNA e, posteriormente, impedir ou paralisar sua replicação. É um fenômeno biológico já naturalmente presente em vários organismos. Compreendido por pesquisadores, passou a ser usado como estratégia para ajudar na melhoria dos processos naturais.

Um dos trabalhos que Aragão realizou com RNAi foi silenciar um gene de uma enzima em soja reduzindo o ácido fítico nos grãos, o que chegou a garantir uma patente do silenciamento para gerar frutos sem sementes. Por causa disso, a Embrapa tem, por exemplo, patente e capacidade de gerar uma tangerina sem sementes, entre outras frutas.
Francisco Aragão explica que um dos exemplos da atuação do RNAi na natureza pode ser dado pela própria soja. "A cor do tegumento das sementes era preta e ficou amarela. Há milhares de anos, uma das cópias de um gene sofreu uma mutação invertida, silenciando um gene que é fundamental para a cor escura. Com o silenciamento, o grão mais conhecido e consumido passou a ser o amarelo, mas ainda existem variedades de cor escura".

Já no ano 2000, a técnica de RNAi começou a ser desenvolvida para obtenção de plantas de feijão resistentes ao mosaico-dourado e isso permitiu que a equipe da Embrapa conseguisse, em 2004, inibir a ação de um gene específico para tornar o feijão resistente ao vírus. Com essa estratégia, as plantas GM produzem pequenos RNA, chamados de siRNA, que bloqueiam um dos genes do vírus, conferindo imunidade ao feijão. Na natureza, quando uma planta de feijoeiro é infectada por esse vírus, também produz, mas tardiamente, esses siRNA. O que a pesquisa fez foi antecipar a deflagração de um mecanismo natural de defesa.

O que ocorre na prática? O vírus é impedido de se multiplicar no feijão. A mosca se alimenta da planta, inocula o vírus, que tem seu gene de replicação silenciado.

A planta do experimento 5
No Brasil foram feitos sucessivos experimentos com a técnica, coordenados pelas equipes de Josias e Aragão. Os experimentos bem-sucedidos avançaram e os fracassados foram sendo abandonados. Josias conta que foi colocada "muita mosca-branca em todos os experimentos, e uma planta do experimento 5, resistiu. Não era bonita, produziu apenas 15 sementes e morreu, mas era resistente". As plantas seguintes, originárias do experimento 5, resistiram a mais de 300 moscas por planta, enquanto todas as testemunhas sucumbiram com altos índices de severidade e até 90% de perda.

O transgene mostrou-se estável ao longo das várias gerações de autofecundação, bem como após cruzamentos com cultivares convencionais, não geneticamente modificados. Exatamente como uma planta de feijoeiro-comum não atacada pelo vírus. Entre as descobertas, a de que a planta matriz deveria ser homozigota (duas cópias do transgene nos cromossomos homólogos) para que a resistência fosse completa.

No mesmo período, artigo na revista científica Nature Biotechnology afirmava que o RNAi não funcionaria para vírus cujo genoma é o DNA. Ou seja, que não era possível obter plantas resistentes a geminivírus usando RNAi. O trabalho dos brasileiros demonstrava o contrário e uma correção foi feita em edição posterior. "Não queríamos que os cientistas perdessem o entusiasmo por uma técnica que era viável. Logo depois, outros grupos de pesquisa desenvolveram milho, tomate e mandioca resistentes a geminivírus, demonstrando que tínhamos razão", diz Aragão.

Em diferentes ambientes, foi avaliada a interação do feijão GM com populações de microrganismos, insetos e artrópodes, bem como seu uso na alimentação de mamíferos, sem qualquer efeito adverso. Também se realizou sua caracterização molecular e análises de composição nutricional. As características foram estáveis tanto nas plantas GM quanto nas testemunhas convencionais.

Evento 5.1, agora Feijão RMD
Assim, em 2010, seis anos após o surgimento da planta mais bem-sucedida, o então chamado "Evento Embrapa 5.1" e agora conhecido por "Feijão RMD" (feijão resistente ao mosaico-dourado), foram concluídos os ensaios de biossegurança. Esses testes mostraram cientificamente que o feijão RMD é tão seguro para o plantio e consumo quanto os feijões que chegam às nossas panelas. Com isso, foi feito um pedido à Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) para o seu cultivo comercial no Brasil.  Mais adiante, aprovado nos testes de biossegurança, tornou-se o primeiro produto geneticamente modificado aprovado e totalmente desenvolvido por uma instituição pública na América Latina. E o primeiro feijão geneticamente modificado no mundo.

Um grande avanço é que o transgene não codifica para uma proteína, como é comum em outras plantas transgênicas − ele foi reconstruído a partir de um fragmento de DNA invertido, formando o que é chamado de "grampo" de RNA após a transcrição. Esse grampo leva à produção dos pequenos RNA, mimetizando o que a natureza já faz para tornar plantas e outros organismos resistentes a patógenos. Observou-se que os RNA se degradam depois do processamento, com a vantagem de que não é associado a nenhum produto químico. Com isso, não ocorre o processo de síntese de proteína. Josias Faria diz que "agora temos uma ferramenta para fazer o manejo integrado do mosaico-dourado. A expectativa é que haja uma redução substancial nas aplicações de pesticidas".

Nos testes, ficou demonstrado que o feijão RMD possui composição nutricional equivalente ao feijão-comum convencional (não GM). Além disso, não há qualquer alteração em relação à qualidade do produto ou ao seu cozimento. E um detalhe importante: após o cozimento não são detectados os pequenos RNA(s), uma vez que essas moléculas são muito instáveis. Sem rastros. É como se a transgenia desaparecesse na panela.  O sucesso dos testes gerou capa na revista científica americana Molecular Plant-Microbe Interaction, em 2007.

As cultivares de feijão RMD que estão sendo desenvolvidas são do grupo comercial Carioca, que possui cerca de 70% do mercado brasileiro e é pouco exportado. Foram oito gerações sucessivas sendo testadas, sempre com total estabilidade do evento transgênico. "Durante o processo de desenvolvimento do feijão RMD, participaram mais de 80 pesquisadores de centros de pesquisa da Embrapa e universidades brasileiras", conta Josias, ressaltando que, novamente, um resultado importante foi viabilizado pelo trabalho em grupo, dentro de uma rede de pesquisadores integrados.

A Embrapa também desenvolveu testes por meio de marcadores moleculares baseados em PCR, reação em cadeia da polimerase, de alta precisão, que permitem determinar quais grãos, sementes ou plantas são GM. Já para situações de campo ou em galpões de armazenamento, está em fase de desenvolvimento um kit prático que distinguirá os lotes transgênicos do produto convencional com maior agilidade.

E ainda havia o Carlavirus
O pedido de liberação comercial foi feito em 2010 e aprovado pela CTNBio em 2011. Desde então, mais testes por todo o Brasil foram realizados em várias condições.

Em 2011, existia o evento de feijão RMD – um grande feito para a pesquisa nacional, mas a variedade comercial ainda não estava disponível, pois outras legislações devem ser cumpridas.  "Os ensaios de avaliação final ou VCU (valor de cultivo e uso) permitiram selecionar o melhor material genético, a partir dos mesmos critérios aplicados às cultivares convencionais", explica Thiago.

Em 2013, os pesquisadores fizeram uma constatação importante durante os testes de avaliação agronômica.
No início do texto, contamos que a mosca-branca é vetora de um conjunto de vírus. O mosaico-dourado é o mais importante, mas existem outros. O Carlavirus, que nos interessa aqui, é conhecido desde a década de 1980, mas estava imperceptível no feijão, já que o mosaico-dourado é mais agressivo, tem sintomas mais acentuados e precoces. Com a exclusão do mosaico-dourado pela tecnologia RMD, os sintomas de Carlavirus tornaram-se visíveis, em alguns locais, trazendo impacto negativo para o desempenho do feijão RMD.

Menos agressivo que o mosaico-dourado, o potencial dano econômico do Carlavirus, que causa necrose na parte inferior de folhas de cultivares, está sendo pesquisado pela Embrapa desde 2014. São estudos agronômicos e de melhoramento genético que buscam reduzir os riscos causados pela doença. 

Mais que um feijão resistente, um Sistema de manejo integrado
Thiago Souza conta que já foram identificadas fontes com efetiva resistência ao Carlavirus entre linhagens elite de feijão, as quais já estão sendo utilizadas pelo programa de melhoramento da Embrapa. Assim, as pesquisas avançam. A solução para o Carlavirus, entretanto, é antiga: manejo integrado. O feijão RMD agora virá cercado de um conjunto de orientações para garantir a segurança da produção, inclusive contra o Carlavirus. Ou seja, genética e manejo.

O presidente da Embrapa, Maurício Lopes, ao enfatizar que todo o processo segue padrões técnicos consagrados e que os prazos são definidos em função dos avanços, diz que "por melhor que seja o produto, é essencial não negligenciar nenhuma de suas características para os agricultores, para o mercado e para a sociedade. Queimar etapas pode resultar em frustrações e prejuízos".

Por isso, os pesquisadores chamam atenção para o fato de que o sistema de manejo também é importante − a cultivar RMD é parte do conjunto. "Temos que pensar sobre o controle das viroses numa perspectiva integrada, em que a genética é importante, mas também é importante a época de plantio, o controle químico, o vazio sanitário. Ou seja, várias ferramentas e estratégias para garantir o correto manejo integrado. Temos que considerar, inclusive, outras culturas que precedem ou que irão suceder a do feijão ou que estão sendo cultivadas simultaneamente". Sob esta perspectiva, ganha vigor a ênfase no desenvolvimento da agricultura a partir da sustentabilidade. "De maneira nenhuma vamos implementar uma solução tecnológica sem pensar no sistema agrícola", diz Thiago.

O registro da cultivar de feijão geneticamente modificado resistente ao vírus do mosaico-dourado-do-feijoeiro ocorreu em setembro, o que tornou a Embrapa oficialmente detentora da variedade para cultivo comercial. O lançamento do feijão RMD será em 2016 e deve ser produzido primeiro em região do Brasil Central.

Os novos investimentos da pesquisa são no desenvolvimento de cultivares mais capazes de enfrentar o Carlavirus e outras pragas e que mantenham a resistência ao mosaico-dourado. Agora, pesquisadores estão usando a mesma técnica para gerar plantas de feijão-caupi e mamão resistentes a viroses. 

Sobre o feijão

O consumo médio de feijão-comum, por brasileiro, é de 17 quilos por ano e a agricultura familiar é apontada como a grande responsável pela produção no País. O feijão é fonte importante de proteínas e de fibras, e também tem ferro e zinco, além de outros minerais. Entre as principais espécies de feijão mais consumidas, destacam-se o feijão-comum e o feijão-caupi. O feijão-comum de maior consumo é de grãos do tipo carioca e preto. O feijão-preto tem maior consumo na região Sul e Sudeste, enquanto o feijão-carioca é aceito em, praticamente, todo o Brasil. O feijão-caupi, também chamado feijão-de-corda, é muito consumido no Norte e Nordeste e, na Embrapa, tem seus estudos liderados pela Embrapa Meio-Norte.

A Embrapa Arroz e Feijão acompanha a série histórica do feijão-comum (que inclui todos os tipos, menos o caupi). Em 2013, a produção foi de 2,6 milhões de toneladas. Em 2011, os estados do Paraná, Minas Gerais, Goiás, São Paulo e Bahia, juntos, representam, praticamente, 80% da produção nacional de 2,7 milhões de toneladas do chamado feijão-comum.

Dados do Mapa mostram que, entre as safras 2013/2014 e 2014/2015, a área de cultivo do feijão aumentou 9,4% e a produção em 8,3%.

O Brasil é o maior produtor de feijão da América Latina com pouco mais de três milhões de toneladas. Em 2014, importou 168.655 toneladas de feijão, principalmente da Argentina, e exportou 65.000 toneladas. 

O feijão está entre os alimentos mais antigos e um dos mais importantes. Pesquisas sugerem que ele evoluiu a partir de espécies selvagens das regiões da América Central e Andes. O feijão original era muito pequeno e cheio de ingredientes antinutricionais. Historiadores atribuem sua disseminação às guerras e explorações.

O feijoeiro-comum enfrenta várias doenças capazes de diminuir a produtividade e prejudicar a qualidade. Essas doenças podem ser de origem fúngica, bacteriana e virótica. Entre as principais fúngicas estão a antracnose, a mancha-angular, a ferrugem, o mofo-branco, a podridão-radicular e a murcha-de-fusário. Entre as bacterianas, o crestamento-bacteriano-comum, a murcha-de-curtobacterium e a podridão-radicular-de-rhizoctonia. O mosaico-comum e o mosaico-dourado são as doenças viróticas de maior importância. O vírus do mosaico-comum é transmitido pelas sementes e por pulgões, enquanto que o vírus do mosaico-dourado é transmitido pela mosca-branca.

Para o controle da maioria dessas doenças, é recomendável utilizar uma combinação de métodos. Entre os mais empregados, práticas culturais, controle químico e uso de cultivares resistentes. 

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Jorge Duarte
Secretaria de Comunicação da Embrapa - Secom

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