Innovation Network in animal reproduction

PC 04 - Desenvolvimento de métodos para elevação da qualidade e fertilidade de gametas usados em biotécnicas de reprodução animal assistida

Um dos maiores desafios da produção animal moderna é aumentar a produtividade individual, de forma rápida, ética e segura. Para tal, a identificação de características fenotípicas de interesse, o conhecimento de suas bases genéticas e sua transferência aos animais das gerações futuras são quesitos obrigatórios. Contudo, técnicas reprodutivas como a inseminação artificial, a inseminação artificial em tempo fixo, a produção in vivo ou in vitro de embriões ainda apresentam rendimentos globais que poderiam ser incrementados, principalmente quando material genético de animais de alto valor biológico, ecológico ou comercial é manipulado. Basicamente, os métodos de processamento e conservação de gametas estão muito aquém de serem considerados ideais, e injúrias estruturais nos ovócitos e espermatozóides têm óbvias conseqüências negativas à sua funcionalidade e fertilidade. Por isso, o presente projeto visa identificar os fatores que afetam a obtenção de gametas e desenvolver alternativas tecnológicas que proporcionem aumento na quantidade, na qualidade e na preservação de ovócitos e espermatozóides, a fim de elevar a eficiência de sua utilização nos sistemas de produção, envolvendo diferentes espécies animais de interesse econômico. Para tal, está estruturado em sete Planos de Ação: um de gestão e seis de pesquisa. Estes abrigam atividades investigativas sobre as bases biológicas da formação e desenvolvimento dos gametas, a identificação de genes promissores relacionados à fertilidade, o desenvolvimento de métodos para a manipulação laboratorial que aumentem o grau de preservação ultra-estrutural, bem como o aperfeiçoamento de técnicas de preservação gamética que possibilitem, após a retomada do metabolismo basal celular, aproximar a fertilidade dos gametas manipulados em laboratório àquela apresentada em situações de fecundação natural. Para tal, estão envolvidos 44 pesquisadores e colaboradores de 7 unidades da Embrapa (CENARGEN, CNPC, CNPGL, CPAC, CPACT, CPATU e CPPSUL) e de 7 instituições parceiras (UFMS, UFPA, UFRA, UNB, UNESP-Araçatuba, UNESP-Botucatu e UNESP-Jaboticabal). Como resultado deste projeto inter-institucional, espera-se desenvolver pelo menos 6 técnicas e/ou processos que, quando aplicados de forma isolada ou seqüencial, sejam capazes de elevar em, no mínimo, 20% o rendimento de processos de biotecnológicos, como a inseminação artificial, a produção in vivo e a produção in vitro de embriões.

Objetivos

  • Identificar os fatores que afetam a obtenção de gametas e desenvolver alternativas tecnológicas que proporcionem aumento na quantidade, na qualidade e na preservação de ovócitos e espermatozóides, a fim de elevar a eficiência de sua utilização nos sistemas de produção, envolvendo diferentes espécies animais de interesse econômico.

Responsável

Dr. Alexandre Rossetto Garcia

Planos de Ação

  • PA 1 - Plano de Gestão
    O grupo gestor será formado pelos líderes de cada Plano de Ação (PA), além de representantes das instituições parceiras. As atividades de planejamento e acompanhamento serão realizada no âmbito deste PA. O gestor será responsável por criação de um ambiente que permita o fluxo contínuo de informações entre os participantes do projeto, além da emissão final de relatórios técnicos-administrativos. Reuniões ordinárias serão realizadas a cada semestre de trabalho, em local a ser estabelecido pelo grupo gestor, a fim de serem acompanhados os investimentos por cada líder de Plano de Ação, além de serem apresentados os resultados parciais obtidos por cada PA e de se construir coletivamente os relatórios ténicos-administrativos.
    OBJETIVOS
    • Compor o grupo gestor.
    • Planejar e acompanhar as atividades técnicas administrativas.
    • Criar um fluxo contínuo de informaçãoes entre os participantes do projeto.
    • Elaborar coletivamente e emitir relatórios técnicos-administrativos.
    • Realizar reuniões ordinárias para deliberação e condução da gestão.
    • Gerenciar os recursos financeiros.
  • PA 2 - Foliculogênese
    A compreensão dos mecanismos de controle da atividade ovariana é necessária para o progresso das biotécnicas da reprodução em fêmeas. Há fortes evidências sugerem o envolvimento de fatores de crescimento no desenvolvimento folicular antral. Contudo, não se conhece a fundo quais os mecanismos estão envolvidos em eventos como o início da puberdade em fêmeas bovinas de origem indiana, quais as variações ocorrentes ao longo do ano quanto às características estrais dessas fêmeas. Ainda mais dúvidas existem quando se consideram as fêmeas bubalinas, que se caracterizam, diferentemente das bovinas, por serem animais poliéstricos estacionais abaixo do paralelo 20oSul. Em termos de produção in vitro de embriões, o estudo de genes candidatos para o desenvolvimento folicular e capacitação ovocitária parece ser de suma importância para a elevação do sucesso na PIVE. Por isso, as atividades de pesquisa do presente PA visam avaliar em maior profundidade as ações dos membros da subfamília FGF-7 no controle da foliculogênese antral, bem como a regulação de sua expressão em folículos antrais bovinos. Outro foco de estudo será o início da puberdade e sua relação com peso e níveis de leptina em linhagem de novilhas Nelore sexualmente precoces. A avaliação das variações das características ovarianas e endócrinas de fêmeas Nelore ao longo do ano servirá como fonte de informação para consolidar conhecimentos sobre sua foliculogênese. Estando a atividade de dinâmica folicular, luteal e endócrina durante o puerpério elucidada em bovinos, resta executar uma atividade de pesquisa com esse fim em bubalinos, estabelecendo as inter-relações entre reprodução, nutrição e metabolismo. O aumento de prolificidade foi identificada em varias linhagens, sendo determinada na sua maioria por mutações de ponto nos genes das proteínas ovocitárias BMP15 e GDF9 (FecGSI) que está associada com aumento na taxa de ovulação espontânea e induzida das ovelhas homozigotas mutantes. Como existe evidência de outras mutações nestes genes que demonstram extensas modificações pós-transcricionais e interação na tradução das proteínas ovocitárias, será também estudada a morfologia e a funcionalidade da população folicular antral de ovelhas portadoras ou não da mutação FecGSI.
    OBJETIVOS
    • Avaliar genes originais ou mutantes, proteínas e outras substâncias capazes de atuar no controle da foliculogênese antral e na capacidade ovulatória de animais, sejam eles púberes, adultos ou em puerpério. Serão monitorados também fatores endócrinos e suas relações com peso do animal, idade, estação do ano, com ênfase em bovinos de corte, além de atividades destinadas a observação de ovinos e bubalinos.
  • PA 3 - Identificação e Manipulação de Fatores Envolvidos na Competência Ovocitária
    Nesse PA serão estudados fatores envolvidos na competência ovocitária, utilizando como modelo ovócitos provenientes de diferentes tamanhos de folículos. Para isso, serão avaliados ovócitos e células do cumulus de folículos de diferentes tamanhos quanto às características morfológicas, capacidade de desenvolvimento embrionário e expressão de genes relacionados à competência. A maturação nuclear e citoplasmática em ovócitos ovinos também será caracterizada para a realização de futuros estudos de competência ovocitária nessas espécies. Além disso, a aspiração folicular em diferentes momentos após a superestimulação hormonal, visando à obtenção de ovócitos mais competentes, será avaliada.
    OBJETIVOS
    • Identificar fatores envolvidos e elaborar estratégias para aumento da competência ovocitária.
  • PA 4 - Estudos Epigenéticos em Gametas
    Serão utilizados ovócitos de vacas aneloradas de abatedouro, oriundos de folículos de diferentes tamanhos (1-3 mm e > 8mm) imaturos e maturados in vitro. A maturação in vitro seguirá protocolo já estabelecido no Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Para a determinação dos níveis de metilação nas regiões diferencialmente metiladas (DMRs) que controlam os genes IGF2R, IGF2 e H19, será utilizada a estratégia de tratamento do DNA genômico com bisulfito de sódio. O bisulfito de sódio tem a característica de transformar Citosina em Uracila/Timina; mas se a Citosina estiver metilada essa transformação não acontece, permanecendo a Citosina na seqüência do DNA. Para isso será utilizado o kit EZ DNA Methylation (ZYMO RESEARCH) ou o CpGenome modification kit (CHEMICON). O DNA genômico será extraído a partir de 100 ovócitos de cada um dos quatro tratamentos, sendo ovócitos de folículos de 1-3 mm imaturos e maturados e > 8 mm imaturos e maturados in vitro (400 ovócitos no total) utilizando a técnica de salting out (Biase et al 2002). Após a extração, para cada tratamento, o DNA será dividido em duas amostras sendo uma utilizada como controle e a outra submetida ao tratamento com bisulfito de sódio. Em seguida, as oito amostras de DNA serão utilizadas com template para amplificação por PCR usando primers específicos para as DMRs em estudo. Os produtos de PCR serão aplicados em gel de agarose, recortados do gel e purificados utilizando o kit Geneclean II (Bio 101 Systems). Os produtos purificados serão clonados utilizando o kit pGem-T easy Vector System (Promega). Para cada tratamento, dez clones serão seqüenciados para a quantificação do padrão de metilação. As seqüências serão comparadas utilizando o programa DNAMAN (Lynnon BioSoft). Para a quantificação da expressão gênica serão utilizados 4 pools de 10 ovócitos cada, oriundos de folículos de 1-3 mm e > 8 mm. Serão 4 tratamentos, ovócitos de folículos de 1-3 mm imaturos e maturados e > 8 mm imaturos e maturados in vitro, portanto 16 pools e 160 ovócitos no total. As amostras de RNA Total dos pools de ovócitos serão extraídas utilizando a técnica do Trizol Reagent, com modificações. A quantificação da expressão dos genes em estudo (IGF2R, IGF2 e H19) entre os tratamentos será realizada utilizando a técnica de RT-PCR semiquantitativa em tempo real. Os dados gerados serão submetidos à análise de variância e teste t ou teste de Mann-Whitney (não-paramétrico), dependendo das suas características.
    OBJETIVOS
    • Avaliar o padrão de metilação das DMRs que controlam a expressão dos genes IGF2R, IGF2 e H19 em ovócitos de folículos de 1 a 3 mm e >8mm de vacas Nelore antes e após a maturação in vitro;
    • Avaliar a expressão dos genes IGF2R, IGF2 e H19 em ovócitos de folículos de 1 a 3 mm e >8mm de vacas Nelore antes e após a maturação in vitro.
  • PA 5 - Caracterização Morfológica e Molecular de Ovócitos Após a Vitrificação
    Nesse estudo, ovócitos bovinos serão vitrificados pelos métodos OPS e Vitringá, às 8, 12 e 24 horas de maturação. Após a desvitrificação, os ovócitos serão avaliados quanto aos aspectos morfológicos e moleculares. Para isso, serão consideradas a aparência, a configuração dos cromossomas e do citoesqueleto, a determinação de apopotose, e a expressão de genes relacionados ao estresse térmico.
    OBJETIVOS
    • Caracterizar as alterações morfológicas, moleculares e a viabilidade de ovócitos vitrificados em diferentes momentos da maturação.
  • PA 6 - Preservação e Avaliação do Sêmen
    Este PA terá como base o desenvolvimento de técnicas de preservação seminal (criopreservação e liofilização) que sejam capazes de diminuir o número de células com lesões estruturais após a preservação e, portanto, aumentar a fertilidade do sêmen. Serão estudadas técnicas para as espécies bovina, bubalina e ovina, além de espécie promissora para região amazônica (Tayassu tajacu).
    OBJETIVOS
    • Desenvolver métodos de preservação e avaliação para aumentar a eficiência de utilização do sêmen.
  • PA 7 - Manipulação de Gametas Para o Desvio da Proporção do Sexo de Produtos
    O presente PA visa estabelecer uma metodologia para o sistema de produção in vitro (PIV) que promova o desvio em favor de embriões de sexo feminino. Serão avaliadas as seguintes metodologias: Grupo 1: gradiente convencional com 45 e 90% em tubos de 15 ml centrifugação de 600 G por 20 minutos (controle). Grupo 2: mini gradiente de 400 µL com 45 e 90% em microtubos centrifugação de 600 G por 20 minutos Grupo 3: mini gradiente de 400 µL com 45 e 90% em microtubos centrifugação a 9000g por 5 minutos (já foi testado no Cenargen (descartar este tratamento) Grupo 4: mini gradiente com densidades acima de 1,123 g/mL em microtubos segundo a metodologia UNESP/Jaboticabal. Serão comparados os seguintes índices nas diferentes metodologias e grupos raciais:
    • taxas de desenvolvimento embrionário e rendimento global;
    • cinética de desenvolvimento;
    • proporção sexual dos embriões viáveis no oitavo dia de cultivo.
    OBJETIVOS
    • Avaliar o efeito de diferentes metodologias de preparação espermática utilizando o gradiente de densidade Percoll na PIV de embriões bovinos das raças Jersey, Holandesa e Nelore.